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仔豬生精細胞體外培養、增殖及分化研究
發布時間:2021-07-20   點擊次數:363次

本實驗通過比較兩種生精細胞(spermatogenenic cell)的培養方法,觀察生精細胞體外培養過程中的生長行為,并檢測增殖分化情況,以建立發生體外培養系統,為進一步研究發生機理奠定基礎,并為治療雄性不孕、闡明環境污染物對雄性生殖的損害提供基礎數據,還能為制備轉基因動物、挽救瀕危野生動物提供新的思路。

 采用生精細胞混合培養和組織塊培養進行仔豬睪丸生精細胞體外培養,分別從生精細胞在體外培養過程存活率、存活時間及分化程度等方面進行比較。結果顯示生精細胞混合培養過程中,檢測第1d)存活率為(91.66±0.46)%,第2d存活率達到(95.41±1.11)%,第3d存活率降低為(94.15±0.32)%;組織塊培養中生精細胞存活率一直較高且穩定,檢測第1d存活率為(96±0.58)%,隨著培養時間延長,存活率逐步上升,第2d、3d存活率均為98%,與混合培養存活率相比,存活率差異極顯著(F=62.15,P<0.001:q=3.59,P<0.001);生精細胞混合培養5d后,生精細胞分化的最高程度為次級精母細胞,組織塊培養9d后生精細胞分化的最高程度為四分體細胞。

 為了進一步了解睪丸組織塊培養體系中生精細胞增殖及分化情況。本實驗采取以下培養條件:DMEM/F12基礎培養基,每毫升培養液中含有100IU青鏈霉素、Vc(10~(-4)M)、VE(10μg/ml)、FSH(10~(-4)mg/ml)、胰島素—轉鐵蛋白(10μg/ml),34℃,5%CO2,95%空氣氣套式二氧化碳培養箱中靜置培養,對仔豬睪丸組織塊進行了2~4周體外培養。

通過溴脫氧核苷尿嘧啶(5′-Bromo-2-deoxyuridine,BrdU)體外標記S期生精細胞DNA,細胞免疫熒光技術檢測生精細胞體外增殖情況;采用HE染色及透射電子顯微鏡技術從普通生態學及超微結構兩個方面檢測體外培養前后生精細胞分化程度。結果顯示:(1)Brdu標記檢測發現,在經過15d,20d體外培養后生精細胞增殖明顯,體外培養15d可見大部分生精細胞以集落形式存在,呈念珠狀或啞鈴狀,少數細胞以單細胞形式存在,集落包含有2-cell、4-cell、6-cell等偶數生精細胞集落,也包含奇數細胞個數的細胞集落,如3-cell、5-cell、9-cell等,主要為小于10-cell細胞集落。

體外培養20d,熒光顯微鏡圖顯示,仍可見許多細胞集落,集落多為2-cell及單個的生精細胞。(2)HE染色結果顯示,體外培養15d,精原細胞通過間橋連接附著于支持細胞上,支持細胞核不規則,以2個核仁常見,偶見正在分裂的次級精母細胞,未見細胞;體外培養第20d,可見多個正在分裂的次級精母細胞,還觀察到Sb、Sc型細胞,Sb型細胞胞核為圓形,胞核為藍紫色,胞核略微偏向一極;Sc型細胞胞核卵圓形,藍紫色,核偏極程度比Sc嚴重,染色質較Sb致密。(3)透射電子顯微鏡結果表明支持細胞胞質不如培養前豐富,線粒體明顯減少、輕度腫脹,內質網無明顯變化。

體外培養后觀察到了2個典型細胞,胞核呈“蘋果"狀,在細胞核頂端有高電子密度頂體囊泡形成,胞核一側可見高爾基體、線粒體和內質網,線粒體由培養前的形態正常、豐富變為培養后的輕度、高度腫脹,且較培養前數量減少。 結論:(1)本實驗條件下組織塊培養生精細胞體外存活率更高,生精細胞分化程度較高:(2)睪丸組織塊培養的生精細胞能夠在體外較好增殖,通過細胞間橋連接小于10個生精細胞集落,生精細胞集落包含偶數、奇數個細胞;(3)HE染色普通形態學及透射電子顯微鏡超微結構均顯示生精細胞能夠在體外分化為細胞。

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